Исследователи из Медицинского института Говарда Хьюза (США) сумели значительно усовершенствовать один из ведущих методов световой микроскопии, который позволяет определять положение флуоресцентных белков в клетках с точностью до 10–20 нм. Ученые создали новую технологию построения изображений, адаптировав принципы интерферометрии к существующей технологии. В результате получены «трехмерные» изображения клеточных структур, с разрешением, до сих пор не виданным в оптической микроскопии.

«Мы создали прекрасный инструмент для наблюдения за процессами, происходящими на клеточном уровне», – уверен д-р Харальд Хесс (Harald Hess, PhD) –директор департамента прикладной физики на исследовательском кампусе Janelia Farm Медицинского института Говарда Хьюза, возглавивший разработку микроскопов нового типа. Предложенная методика получила название iPALM – interferometric PhotoActivated Localization Microscopy, интерферометрическая светочувствительная локализационная микроскопия); основой для ее реализации послужила технология PALM, предложенная д-ром Хессом и его коллегой д-ром Эриком Бетцигом (Eric Betzig) в 2005 году.

Суть метода PALM состоит в том, что введенные в клетку флуоресцентные метки активируются (и деактивируются) постепенно, с помощью световых импульсов: на каждом из снимаемых изображений «включается» лишь малая их часть. При объединении нескольких тысяч таких изображений создается цельная иллюстрация всей исследуемой структуры, на которой отдельно отмечен каждый флуоресцентный белок. В результате ученые получают гораздо более четкую картину, чем в случае применения методов традиционной флуоресцентной микроскопии.

Совершенствованием методики PALM занимались оба ее изобретателя: д-р Бетциг пытался приспособить технологию для исследования живых клеток и флуоресцентных белков разного цвета свечения, а д-р Хесс собирался обеспечить получаемым изображениям дополнительное, третье, измерение. Довольно быстро д-р Хесс пришел к выводу о том, что лучшим способом определения глубины расположения белка в образце будет интерферометрия, и уже в сентябре 2006 года он предложил идею iPALM. «Интерферометрия — один из самых точных методов измерения, — объясняет ученый. — Если у вас есть источники света достаточной яркости, появляется возможность измерять сверхмалые величины».

Прежде исследователю приходилось использовать классические интерферометрические методы для классических же задач – поиска неровностей на поверхности пластин жесткого диска. Измерения проводились следующим образом: световая волна посылалась в сторону изучаемой поверхности, отражалась от нее и сравнивалась с «эталонной», отраженной от зеркала, которое устанавливалось на известном удалении от источника. При обнаружении малейшего отличия расстояния между пластиной и источником от заданного приемник фиксировал смещение фаз отраженных волн друг относительно друга. По измеренному значению амплитуды суммарной волны (в идеале оно должно быть нулевым) определялась высота неровности с точностью до нанометров.

Основная сложность применения указанной технологии для изучения биологических образцов состоит в том, что свет испускается не лазером, а флуоресцентными молекулами, находящимися внутри исследуемого объекта. Проблема получения «эталонной» волны была решена методом расщепления фотонов; каждый квант света, таким образом, служил образцом для самого себя. С помощью стандартного PALM-микроскопа частицы собирались с обеих сторон пробы, а затем два световых пучка посылались на светоделительный элемент, который расщеплял их и направлял к трем отдельным камерам. По результатам измерения интенсивности пучков, попавших в каждую из камер, делался вывод о глубине расположения метки в пробе.

Изображение клетки с введенными в нее флуоресцентными белками. Глубина расположения молекул определяется цветом: красный соответствует самым нижним слоям, фиолетовый — наиболее приближенным к наблюдателю (изображение получено д-ром Х. Хессом).

По мнению д-ра Хесса для функционирования новой технологии достаточно лишь небольшого количества фотонов, что важно с практической стороны и существенно превосходит по эффективности существующие методики.

Евгений Биргер