Российские ученые совместно с коллегами из Словении провели анализ защитного кожного секрета травяной лягушки Rana temporaria из популяции, обитающей в Центральной Словении, и сравнили результаты тестов с таковыми для московских земноводных. Оказалось, что состав секрета животных разных регионов различается, а значит, по нему можно определить их родину.

Кроме того, авторы усовершенствовали безопасный для лягушек способ, помогающий получить больше слизи, а также разработали эффективные методики работы с ней. Они лягут в основу исследований биологических активностей кожного секрета — его противомикробные и регенеративные свойства помогут разработать новые лекарства.

Результаты исследования, поддержанного грантом Президентской программы Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в журнале Analytical and Bioanalytical Chemistry.

Травяные ранидные лягушки — один из самых распространенных родов лягушек в Европе. Слизь с поверхности кожи — их единственная защита от всех опасностей. Поэтому в процессе эволюции у каждой популяции сложился уникальный состав кожного секрета в зависимости от возможных угроз, существующих в конкретной среде обитания.

В одних группах активные пептиды слизи вызывают рвотный рефлекс у рыб, заставляя их выплюнуть жертву. Слизь травяных лягушек из других местностей вызывает такую боль у хищных птиц, что те не могут закрыть клюв и проглотить добычу. Пептиды других популяций отвечают за защиту от грибков, вирусов и вредных бактерий и способны ускорять регенерацию мягких тканей. Поэтому для ученых важно изучить состав и структуру каждого пептида и понять, как именно он действует.

Для определения структуры активных веществ авторы использовали метод масс-спектрометрического анализа с предварительным хроматографическим разделением компонентов смеси: ионизируя молекулы вещества, они фиксировали отношение их массы к заряду, и с учетом атомных масс элементов устанавливали состав молекул и их активных фрагментов. Сравнивая пептиды словенской и московской популяции травяных лягушек, ученым удалось не только сделать прогноз о функциях найденных пептидов, но и найти новый способ различать виды и популяции лягушек.

«Часто бывает сложно определить, к какому виду относятся особи, ведь они очень похожи между собой. Даже у опытных биологов с этим возникают проблемы. Однако теперь, когда известно, что у каждого вида лягушек есть свой собственный набор пептидов, определить принадлежность особи будет легко. Более того, теперь существует возможность узнать и то, к какой именно популяции она относится — ранее не было ни одного способа, позволяющего это сделать. Так что мы можем говорить о настоящем открытии», — делится Альберт Лебедев, доктор химических наук, профессор кафедры органической химии химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова и заведующий лабораторией физико-химических методов анализа строения вещества.

Основная цель исследователей — найти такой способ изучения структуры пептидов, при котором не нужно будет проводить дополнительные химические реакции, предваряющие масс-спектрометрический анализ и приводящие к потерям целевых компонентов или загрязнению образца побочными продуктами. Есть проблемы и с количеством образцов, поскольку сбор кожного секрета лягушек — также трудоемкий процесс. Обычного количества кожного секрета, выделяемого одной особью, недостаточно.

Авторы статьи использовали безвредный для лягушек метод мягкого электростимулирования, разработанный в Австралии в конце прошлого века. Ученые водили вдоль спин амфибий электродами, после чего слизь начинала выделяться более эффективно. Такая процедура проводится раз в пару недель, чтобы подопытные смогли восстановить «баланс» секрета.

Наконец, основная сложность состоит в том, что активные пептиды, выделяемые организмом лягушки, выполняют свою функцию в считанные секунды. Уже через минуту в только что взятом образце слизи не остается никаких действующих веществ. Все из-за ферментов, которые останавливают работу выполнивших свою функцию пептидов до того, как они смогут навредить организму хозяйки. Но и для этой проблемы нашлось решение. Одним из наиболее эффективных вариантов является смыв слизи с кожи водой в контейнер с метанолом, который дезактивирует ферменты. Полученный водно-метанольный раствор фильтруют, а фильтрат используют для изучения активных пептидов.

Эти методы будут использоваться и в будущих исследованиях. Уже планируется выяснить действие новых пептидов на грибки, бактерии и вирусы, а также изучить их противораковый потенциал. Ученые собрали особей других видов и теперь выясняют возможность альтернативных способов стимулирования секреции слизи.

«Главная проблема современных лекарственных препаратов заключается в том, что вредные микроорганизмы быстро вырабатывают к ним устойчивость. Фармакологические компании тратят миллионы на разработку новых антибиотиков, а в результате большая их часть через некоторое время становится бесполезной. С активными пептидами из кожного секрета травяной лягушки все по-другому. Так как они совершенно иначе действуют на микроорганизмы, бактерии не вырабатывают к ним устойчивости, хотя природа их воздействия до конца еще не изучена. Именно по этой причине лягушки живут на планете уже более 300–400 миллионов лет. Вот почему мы надеемся, их пептиды могут стать основой для лекарств будущего поколения», — объясняет Альберт Лебедев.