Американские ученые разработали методику, позволяющую отслеживать клеточные линии in situ, то есть без перемещения клеток. Это позволит отслеживать траектории пролиферации отдельных клеток в ходе развития эмбрионов или опухолей, не разрушая их. Описание метода приводится на страницах журнала Nature.

Клеточные линии (у прокариот — штаммы) представляют собой совокупность клеток, произошедших от единственной клетки-прародителя. В настоящее время их изучают по набору накопленных спонтанных точечных мутаций путем полногеномного анализа. Этот метод требует выделения клеток с извлечением из них ДНК.

Различные «блокноты со штрихкодами» в двух клетках. Kirsten L. Frieda et al., Nature, 2016

Сотрудники Калифорнийского технологического университета и Мединститута Говарда Хьюза разработали генетическую метку, названную ими barcoded scratchpad («блокнот со штрихкодом»), благодаря которой можно отслеживать клеточные линии in situ. Эта метка представляет собой генетический элемент из 10 повторяющихся фрагментов (20 шпилек). К каждому из них прикреплена последовательность, служащая «штрихкодом». Помимоэтих структур в ДНК материнской клетки вводятся гены индуцируемой нуклеазы Cas9 и направляющей ее гидовой РНК (гРНК), которая экспрессируется вместе с флуоресцентным белком. Всего в разные участки генома вводится несколько десятков «блокнотов со штрихкодом» (в эксперименте с линией мышиных эмбриональных стволовых клеток ученые использовали 28).

Направленная гРНК нуклеаза Cas9 способна вызывать необратимый коллапс отдельных шпилек («вырывать листки из блокнота»),оставляя «штрихкоды» нетронутыми. В ходе пролиферации клетки индуцированная активность нуклеазы постепенно и случайно «вырывает» отдельные «листки» в каждом из десятков «блокнотов со штрихкодами» каждой дочерней клеточной линии, что приводит к появлению индивидуальных наборов «блокнотов со штрихкодами» в них.

Такие индивидуальные наборы можно визуализировать с помощью флуоресцентной гибридизации одиночных молекул РНК in situ (smFISH). Эта технология позволяет определять отдельные транскрипты мРНК (в данном случае продукты «блокнотов со штрихкодами») с помощью набора олигонуклеотидов (около20 пар оснований), каждый из которых комплементарен одному флюорофору взаданной мРНК. К искомой мРНК присоединяется много таких олигонуклеотидов (а неодиночные, как к случайно совпавшим последовательностям в других мРНК), что приводит к ее яркой флуоресценции внутри клетки.

Принцип действия методики. Kirsten L. Frieda et al., Nature, 2016

Определяя методом smFISH наборы «блокнотов со штрихкодами» каждой клетки можно определить ее место в «генеалогическом дереве» изучаемой клеточной линии, то есть проследить историю пролиферации клетки-прародителя. Вся методика получила название MEMOIR («МЕМУАР») от английского Memory by Engineered Mutagenesis with Optical In situ Readout («Запоминание путем искусственного мутагенеза с оптическим считыванием *in situ*»)

Как пишут исследователи, MEMOIR может найти применение в изучении клеточных траекторий развития эмбрионов, опухолей и других многоклеточных биологических систем, не нарушая их пространственную организацию.

Подобные исследования необходимы для понимания механизмов и стадий развития живых существ в норме и при патологии, а также злокачественных опухолей для разработки методов их диагностики и лечения.

Автор: Олег Лищук