Химики из США и Швейцарии под руководством Майкла Майера (Фрибурский университет) разработали методику определения единичных молекул белков по их поведению в зептолитровом объеме специально сконструированной нанопоры. Ученые нашли способ определять одновременно форму, объем, электрический заряд, дипольный момент и вращательные характеристики молекул. По словам авторов, эта методика может найти применение в поиске биомаркеров заболеваний и рутинном анализе белков. Исследование опубликовано в журнале Nature Nanotechnology, кратко о нем сообщает пресс-релиз Университета Мичигана.

Частицы с разным дипольным моментом по-разному ориентируются в канале и меняют его электрическое сопротивление. University of Michigan

На сегодняшний день задача определения белка по его одиночной молекуле решена не полностью. Современные методы требуют каким-либо образом модифицировать белок (химически или физически), добавив к нему опознавательный знак — флуоресцентную или изотопную метку. Вместе с тем, задача определения белков актуальна, например, для поиска маркеров заболеваний или исследования протеома (совокупности всех белков) организмов. 

Схема эксперимента. Между двумя растворами электролита находится непроводящая мембрана с нанопорой. University of Michigan

Среди методов, позволяющих работать с одиночными молекулами белка можно выделить использование нанопор. В таких установках используется пара сосудов с электропроводящими растворами, которые соединены порой с диаметром в несколько десятков нанометров. В одном из сосудов находится раствор белков. Между сосудами подается напряжение и заряженные молекулы белка перемещаются через отверстие под действием электрического тока — происходит электрофорез. 

В момент попадания молекулы пору в капилляр изменяется ток через систему. Это связано с тем, что белок сопоставим по размерам с просветом отверстия и он изменяет поток ионов через него. По характерному времени прохождения молекулы и изменению тока можно определить некоторые гидродинамические характеристики частицы, например, ее форму. 

Типичные изменения в силе тока через пору: a — для стрептавидина, b — для иммуноглобулина. Erik C. Yusko et al. / Nature Nanotechnology, 2016

Авторы новой работы расширили количество характеристик, измеряемых на основе движения через пору, до пяти, что позволит уточнить . Для этого химики модифицировали строение поры, добавив на ее поверхность слой ПАВ и специальных удерживающих фрагментов, заставляющих частицу вращаться при движении сквозь отверстие. Это позволило ученым получить данные о характере броуновского вращения молекулы белка, а также оценить ее поверхностный заряд. Ориентация белка при движении сквозь пору позволяла определить его дипольный момент.

Для анализа экспериментальных данных химики построили модель колебания тока при движении молекул через 10–30-нанометровую пору. В ней форма белка представлялась эллипсоидом вращения (приплюснутым или вытянутым шаром). Химики проверили модель на 10 различных белках, среди которых иммуноглобулин G1, стрептавидин, бычий сывороточный альбумин и альфа-амилаза. Объем поры составлял секстиллионную долю литра — около одного зепталитра.

Белки, на которых отрабатывалась модель. Синие эллипсоиды — форма и объем белка, установленные экспериментально. Erik C. Yusko et al. / Nature Nanotechnology, 2016

Авторы показали, что форма и размер молекул, получающиеся при анализе эксперимента, хорошо соответствуют действительности. Кроме того, ученые опробовали технику на смеси состава белок-антитело (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и поликлональное антитело). Химикам удалось надежно отличить белковые комплексы от одиночных молекул по падению тока в приборе.

Молекулы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (слева) и ее комплекса с иммуноглобулином G (справа). Синие шары — формы частиц согласно анализу экспериментальных данных. Снизу — отличия в параметрах комплекса и индивидуальной частицы, определенные из эксперимента (объем, вращательные характеристики и дипольный момент). Erik C. Yusko et al. / Nature Nanotechnology, 2016

Ученые сравнивают работу с методиками секвенирования ДНК через пору, предлагающими определять последовательность азотистых оснований в молекуле, пропуская ее через нанометровое отверстие и измеряя при этом электрический ток. Химики допускают, что в будущем новый метод может позволить идентифицировать отдельные белки по набору их внешних характеристик, а также позволит создать устройства, способные сортировать белки на уровне отдельных молекул. 

Автор: Владимир Королёв