Ученые Массачусетского технологического института (Massachusetts Institute of Technology, MIT) доказали, что им под силу включать и выключать гены в клетках как дрожжей, так и человека, контролируя процесс копирования ДНК в РНК – достижение, которое позволит лучше понять функции этих генов.

Кроме того, вновь разработанная технология облегчит процесс создания инженерных клеток, способных отслеживать изменения в окружающей их среде, синтезировать лекарства или выявлять заболевания, считает Тимоти Лу (Timothy Lu), MD, PhD, доцент кафедры электротехники и компьютерных наук и биологической инженерии, старший автор статьи, опубликованной в журнале ACS Synthetic Biology.

«Я думаю, этот метод значительно облегчит процесс создания синтетических схем», – говорит доктор Лу, научный сотрудник Центра синтетической биологии (Synthetic Biology Center) MIT. «Он должен изменить масштаб и ускорить создание самых разных синтетических схем в дрожжевых клетках и клетках млекопитающих».

Новый метод основан на системе вирусных белков, которые в последнее время используются для редактирования генома бактериальных и человеческих клеток. Оригинальная система, называемая CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat), состоит из двух компонентов: белка, который связывается с ДНК и разрезает ее, и короткой цепочки РНК, направляющей этот белок к нужному участку генома.

«Система CRISPR является достаточно мощным инструментом: она может быть сориентирована на различные участки ДНК путем простого перекодирования этих направляющих РНК», – говорит Лу. «Простым перепрограммированием РНК-последовательности этот белок можно направить к любому нужному вам участку генома или синтетической схемы».

В предыдущих исследованиях система CRISPR использовалась для вырезания фрагментов гена с целью инактивировать его или для замены одного гена другим. Доктор Лу и его коллеги решили использовать систему CRISPR для другой цели – контроля над транскрипцией генов, то есть над процессом копирования последовательности ДНК в матричную РНК (мРНК), несущую инструкции данного гена.

Тимоти Лу (Timothy Lu), MD, PhD.
(Фото: MIT)

Транскрипция жестко регулируется белками, называемыми факторами транскрипции. Эти белки связываются со специфическими последовательностями ДНК в промоутерной области гена и либо включает, либо блокирует ферменты, необходимые для его копирования в мРНК.

Доктор Лу и его коллеги адаптировали систему CRISPR так, чтобы ее можно было использовать в качестве фактора транскрипции. Сначала они модифицировали обычный CRISPR-белок (Cas9) таким образом, что его связывание с ДНК больше не приводит к ее разрезанию, а затем добавили к Cas9 сегмент, активирующий или подавляющий экспрессию гена путем изменения транскрипционного механизма клетки.

Чтобы белок Cas9 оказался в нужном месте, в клетки-мишени доставляется ген направляющей его РНК – так называемой гид-РНК (guide RNA), – соответствующей последовательности ДНК промоутерной области гена, который нужно активировать.

Эксперименты подтвердили, что в результате соединения гид-РНК и белка Cas9 в клетке инициируется селективная транскрипция конкретного гена-мишени. К удивлению исследователей, этот же Cas9-комплекс может быть использован и для блокирования транскрипции, если сделать его мишенью другую часть гена.

«Это просто замечательно, что наша система позволяет осуществлять и положительное, и отрицательное регулирование одним и тем же белком с разными гид-РНК, мишенями которых являются разные участки промоутера», – говорит доктор Лу.

Новая система должна быть гораздо проще в использовании, чем две другие недавно разработанные системы контроля над транскрипцией на основе ДНК-связывающих белков, известные как «цинковые пальцы» и TALENs (transcription activator-like effector nucleases), считает ученый. При всей их эффективности инженерия и сборка этих белков являются трудоемким и дорогостоящим процессом.

«Система CRISPR очень гибка, и это объясняется тем, что вам больше не нужно тратить время на инженерию белков. Можно просто изменить последовательность РНК», – продолжает Лу.

Ученые разработали и систему контроля над транскрипцией: теперь она может быть индуцирована определенными малыми молекулами, например, сахарами, которые можно добавить в клетку. Для этого они разработали такие гены гид-РНК, транскрипция с которых осуществляется только в присутствии того или иного низкомолекулярного соединения. Без малых молекул гид-РНК не синтезируются, и, следовательно, ген-мишень остается нетронутым.

Такой тип управления транскрипцией может оказаться полезным при изучении роли природных генов путем их включения и выключения на определенных этапах развития или в процессе прогрессирования заболевания.

Оригинальная статья

Tunable and Multi-Functional Eukaryotic Transcription Factors Based on CRISPR/Cas