Светящаяся зеленая молекула, известная как зеленый флуоресцентный белок (GFP) произвела революцию в молекулярной биологии. Когда GFP связан с определенным белком внутри клетки, ученые могут легко идентифицировать этот белок и определить его местоположение с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако GFP нельзя использовать в электронной микроскопии, позволяющей достичь гораздо более высокого разрешения. Химики Массачусетского технологического института (Massachusetts institute of technology, MIT) разработали эквивалент GFP для электронной микроскопии – маркер, который позволяет ученым помечать белки и визуализировать их с беспрецедентной четкостью.

Флуоресцентная микроскопия не позволяет различать клеточные объекты, размер которых измеряется в нескольких нанометрах, например, внутренние структуры митохондрий.

«Но это позволяет сделать электронная микроскопия» – говорит Джефф Мартелл (Jeff Martell), химик-аспирант и ведущий автор статьи о новом маркере, опубликованной онлайн в журнале Nature Biotechnology.

Флуоресцентные микрофотографии клеток человека, полученные с помощью традиционной (слева) и конфокальной микроскопии (справа).
Митохондрии окрашены красным. (Фото: личный архив Г. Г. Борисенко, thesaurus.rusnano.com)

Только что созданный маркер может помочь ученым точно определить местоположение многих клеточных белков, что, по мнению исследователей, облегчит их изучение и углубит понимание их функций.

Названный APEX, новый маркер очень похож на природные белки, которые уже были опробованы в электронной микроскопии. Один из широко используемых маркеров – пероксидаза хрена (horseradish peroxidase, HRP), но он работает не во всех компартментах клетки. Другие недавно разработанные маркеры работают по всей клетке, но технически сложны в использовании, так как требуют освещения образца и пропускания через него кислорода.

Чтобы усовершенствовать этот метод, ученые начали с белка, похожего на HRP, – аскорбатпероксидазы (ascorbate peroxidase, APX). Как маркер APX более универсальна, чем HRP, и может функционировать в цитоплазме клетки. Кроме того, она не требует света.

Как HRP, так и APX относятся к пероксидазам – классу ферментов, участвующих в процессе, известном как окисление. Каждая пероксидаза имеет собственные мишени, и одной из основных мишеней HRP является молекула, называемая диаминобензидином (diaminobenzidine), сокращенно DAB. Молекулу DAB, при окислении, можно визуализировать с помощью электронной микроскопии. Ученые генетически модифицировали APX таким образом, что DAB стал и ее мишенью.

Чтобы использовать APEX («инженерную APX»), исследователи доставляют в живую клетку небольшое кольцо ДНК, содержащее ген APEX, связанный с геном белка, который планируется визуализировать. Такая клетка синтезирует белок-мишень, связанный с белком APEX.

Теперь ученым нужно доставить в клетку DAB, который обычно там не присутствует. Это делается во время процесса «фиксации», или стабилизации, клеток – обязательной в электронной микроскопии процедуры.

Когда белок APEX окисляет DAB, образуются радикалы, которые быстро слипаются в полимер. Этот полимер можно обнаружить с помощью электронного микроскопа, что позволяет точно определить местоположение белка-мишени.

Электронная микрофотография митохондии, матрикс которой окрашен APEX и выглядит темным. Более светлые структуры в матриксе представляют
межмембранное пространство. (Фото: Tom Deerinck and Jeff Martell)

Чтобы продемонстрировать возможности своего нового маркера, исследователи взялись за решение вопроса о расположении белка кальциевых каналов, открытого в прошлом году. Ученые обеих исследовательских групп, идентифицировавших этот белок, согласны в том, что он находится в митохондриях, но выдвигают противоречивые теории относительно его точного местоположения и ориентации. Используя новую технологию визуализации, группа, руководимая специалистами из MIT, пометила этот белок с помощью APEX и определила, что он встроен во внутреннюю мембрану митохондрии и обращен в сторону митохондриального матрикса.

Как показали эксперименты, с помощью новой инженерной молекулы можно маркировать белки по всей клетке – не только в митохондриях, но и в ядре, эндоплазматической сети и цитоплазме.

В настоящее время ученые работают над заполнением своими маркерами всей клетки, например, нейрона. Это позволит выделить такие нейроны на электронном изображении и легче отследить межнейронные связи. В рамках этого проекта ученые MIT сотрудничают с профессором молекулярной и клеточной биологии Гарвардского университета (Harvard University) Джошуа Сэйнсем (Joshua Sanes), высоко оценивающим новый метод маркировки.

«Мы хотим определить точные связи между этими клетками, и APEX – хороший способ маркировки клеток для электронной микроскопии. Мы можем пометить определенные типы клеток и выяснить, как они вписываются в нейронную сеть», – поясняет профессор Сэйнс.

Авторами разработки являются уже упомянутый Джефф Мартелл и старший автор статьи в Nature Biotechnology Элис Тинь (Alice Ting). В работе принимала участие большая группа исследователей, в числе которых ученые Гарвардской медицинской школы (Harvard Medical School), Калифорнийского университета в Сан-Диего (University of California at San Diego), Калифорнийского университета в Ирвине (University of California at Irvine), Массачусетской общей больницы (Massachusetts General Hospital).

Тинь и Мартелл уже подали заявку на патент на свою технологию и сейчас работают над повышением стабильности молекулы APEX и усилением ее способности связываться с гемом (атомом железа в составе органических соединений), без чего APEX не может работать должным образом.

Аннотация к статье

Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy