Используя химические «нановзрывы», создающие мельчайшие отверстия в защитных мембранах клеток, ученые разработали принципиально новый метод доставки малых терапевтических молекул, белков и ДНК непосредственно в живые клетки.

Поле клеток рака предстательной железы
человека после воздействия активированными
углеродными наночастицами. Большинство клеток
(показаны зеленым) – это клетки, поглотившие
модельное терапевтическое соединение кальцеин,
в то время как меньшинство (показаны красным) –
погибшие клетки. Каждая зеленая и красная
точка представляют собой отдельную клетку.
(Фото: Прерона Чакраварти)

Углеродные наночастицы, активированные вспышками лазера, вызывают крошечные взрывы, которые образуют отверстия в клеточных мембранах. Отверстия остаются открытыми достаточно долго для того, чтобы позволить терапевтическим агентам, находящимся в окружающей жидкости, попасть в клетку. Регулируя лазерное излучение, ученым удалось ввести низкомолекулярные маркерные химические соединения в 90 процентов целевых клеток, сохранив при этом живыми более 90 процентов подвергшихся воздействию клеток.

Исследование финансируется Национальным институтом здравоохранения (National Institutes of Health) и Институтом бумажной науки и технологии (Institute of Paper Science and Technology) Технологического института Джорджии (Georgia Institute of Technology). Оно будет опубликовано в августовском номере журнала Nature Nanotechnology.

«Этот метод позволяет нам доставлять в клетки целый ряд терапевтических препаратов, которые сейчас не могут туда попасть», – говорит Марк Прауснитц (Mark Prausnitz), профессор Школы химической и биохимической инженерии (School of Chemical and Biomolecular Engineering) Технологического института Джорджии. «Одним из наиболее значимых применений этого метода может стать его использование в генной терапии, которая имеет большие перспективы в медицине, но ограничена сложностью доставки в клетки ДНК и РНК».

Работа представляет собой первое использование активации реактивных углеродных наночастиц лазерным излучением для применения в медицине. Для использования этого метода на людях потребуются дополнительные исследования и клинические испытания.

Ученые уже не одно десятилетие добиваются более эффективной доставки в клетки ДНК и РНК, используя для этого различные методы, включая введение вирусов для переноса генетического материала, покрытие ДНК и РНК химическими веществами и применение электрических полей и ультразвука, чтобы открыть клеточные мембраны. Однако предшествующие методы в основном страдают низкой эффективностью или далеко небезопасны.

Вдохновленные предыдущей работой над так называемым «фотоакустическим эффектом» Прауснитц и его коллеги Прерона Чакраварти (Prerona Chakravarty), Вэй Цянь (Wei Qian) и Мостафа Эль-Сайед (Mostafa El-Sayed) разработали метод, с помощью которого надеются добиться более точной локализации энергии на клеточных мембранах, создав таким образом более безопасный и эффективный подход к внутриклеточной доставке лекарственных препаратов.

Их метод начинается с введения частиц углеродной сажи размером 25 нанометров в диаметре в окружающую клетки жидкость, содержащую терапевтические агенты, которые должны попасть в клетки. Вспышки излучения ближнего инфракрасного диапазона фемтосекундного лазера воздействуют на жидкость со скоростью 90 миллионов импульсов в секунду. Углеродные наночастицы поглощают нагревающий их свет, в свою очередь разогревая окружающую жидкость до образования пара. Пар реагирует с углеродными наночастицами с образованием водорода и монооксида углерода.

Два газа образуют пузырек, который растет благодаря поступлению энергии лазера. При отключении лазера пузырек резко схлопывается, вызывая ударную волну, создающую отверстия в мембранах близлежащих клеток, что позволяет терапевтическим веществам из окружающей жидкости проникнуть в клетки. Отверстия закрываются очень быстро, и их образование не наносит клеткам существенного вреда.

Исследователи продемонстрировали, что, используя свой метод, они могут ввести через мембраны в клетки рака простаты человека и глиосаркомы крыс небольшие молекулы кальцеина, белок альбумин сыворотки бычьей крови и плазмидную ДНК. Поглощение кальцеина было отмечено в 90 процентах клеток при уровне лазерного облучения, оставляющем живыми более 90 процентов клеток.

«Мы смогли добиться поступления почти во все клетки молекул, которые обычно в них не попадают, и почти все клетки остались живыми», – говорит ведущий автор исследования Прерона Чакраварти. «Наша основанная на активированных лазером углеродных наночастицах система позволяет проводить контролируемые внутренние взрывы пузырьков, которые разрушают клеточные мембраны ровно насколько, чтобы молекулы могли попасть в клетки, не причиняя им при этом непоправимого вреда».

Чтобы оценить, как долго отверстия в клеточной мембране остаются открытыми, ученые удалили из жидкости условные терапевтические средства на то время, когда клетки подвергались воздействию лазера, а затем через одну секунду после прекращения его работы снова добавили химические вещества. Они не увидели почти никакого поглощения молекул, что дает основания полагать, что клеточные мембраны закрываются очень быстро.

Поле клеток рака предстательной железы
человека после воздействия на них активированными
лазером углеродными наночастицами.
Мембраны клеток окрашены красным для улучшения
визуализации. Каждый из красных кружков
представляет собой отдельную клетку.
(Фото: Прерона Чакраварти)

Чтобы подтвердить, что решающим фактором образования ударных волн является реакция взаимодействия пара с углеродом, исследователи заменили углеродные наночастицы на золотые до воздействия лазером. Так как необходимый для реакции углерод отсутствовал, наночастицы золота вызвали лишь незначительное поглощение молекул клетками.

Ученые заменяли углеродные наночастицы и на углеродные нанотрубки, и также отметили незначительное поглощение молекул, что может объясняться более низкой реактивностью нанотрубок по сравнению с частицами углеродной сажи.

Дальнейшие эксперименты также показали, что введенные в клетки с помощью активируемых лазером наночастиц молекулы ДНК сохраняют свою функциональность и способны вырабатывать белки. Когда в раковые клетки была введена плазмидная ДНК, кодирующая выработку люциферазы, экспрессия фермента возросла в 17 раз.

В будущем исследователи планируют изучить возможность использования менее дорогого наносекундного лазера, чтобы заменить им сверхбыстрый фемтосекундный инструмент, использованный в исследовании. Они также собираются оптимизировать углеродные наночастицы с тем, чтобы за время воздействия лазером почти все они были использованы. Остающиеся в организме углеродные наночастицы не должны оказывать отрицательного воздействия, даже если организм может оказаться не в состоянии удалить их, отмечает Прауснитц.

Это первое исследование, доказывающее состоятельность принципа применения активируемых лазером реактивных углеродных наночастиц для доставки в клетки лекарственных препаратов и генов», – говорит ученый. «Впереди еще долгий путь до внедрения этого метода в медицину, но мы уверены, что наш подход в конечном итоге станет новой альтернативой доставки в клетки терапевтических агентов более эффективным и безопасным способом».

Аннотация к статье: Prerona Chakravarty, Wei Qian, Mostafa A. El-Sayed & Mark R. Prausnitz. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses