Дорогие читатели, Нашему шестнадцатилетнему, волонтёрскому и некоммерческому проекту для создания новой, современной версии N-N-N.ru, очень нужно посоветоваться касательно платформы нашего сайта – SYMFONY & DRUPAL 8. Платформа не простая, но обещаем – мы не займём много времени, просто нужна консультационная поддержка квалифицированного разраба. Если вы можете помочь, то связаться с нами можно на страницах Facebook.com здесь и здесь.

Углеродные нанотрубки проходят сквозь клеточные стены

-->

Перспективы применения углеродных нанотрубок (УНТ) в биологии и медицине во многом связаны с их уникальной способностью проникать через клеточную мембрану. Благодаря этому могут быть разработаны системы доставки различных молекул в клетку [1]

Однако большинство исследований, проведенных до сих пор, относится к клеткам животных. Создание неразрушающих систем доставки в клетки растений тоже очень важно как для научных исследований, так и для практических применений, например, для ввода меток. Однако в отличие от клеток животных почти все клетки растений имеют дополнительную оболочку – кроме мембраны они окружены еще и плотной клеточной стенкой из полисахаридов и целлюлозы. Прочные клеточные стенки служат опорой организму растений, но для доставки молекул внутрь таких клеток требуется использовать сложные методы, например, “генную пушку”, которая разгоняет микрочастицы с адсорбированными на них ДНК и выстреливает их в ткани растений. Не помогут ли и здесь углеродные нанотрубки?

Результаты, полученные китайскими учёными [2], показывают, что действительно на основе УНТ могут быть разработаны системы доставки различных молекул в клетки растений! В своих экспериментах авторы сначала использовали суспензию оксидированных одностенных нанотрубок ОСНТ, к которым нековалентным способом была присоединена флуоресцентная метка FITC (fluorescein isothiocyanate). Длина нанотрубок не превышала 500 нм. В стандартной среде роста в течение 2 ч при 26оС была проведена инкубация клеточной культуры табака (Nicotiana tobacum BY-2) с добавлением ОСНТ/FITC. C помощью конфокальной микроскопии авторы продемонстрировали, что ОСНТ проникают в клетки растения – интенсивный флуоресцентный сигнал от FITC наблюдался внутри почти всех клеток (рис.1).

BY-2.jpgРис. 1. Микрофотографии клеток BY-2 после инкубации с ОСНТ: А – светлопольное изображение; В – флуоресцентное изображение; С- изображение, полученное методом дифференционно-интерференционного контраста при большом увеличении; D – флуоресцентное изображение при большом увеличении; Е – наложение С и D. (масштабная шкала 100 мкм для А и В и 10 мкм для С-Е)

Сигнал, зарегистрированный после инкубации клеток в среде роста с тем же количеством FITC, но без ОСНТ, оказался сравнимым с контрольным сигналом от самих клеток (рис.2). Это означает, что флуоресцеин преодолевает клеточные стенки только с помощью нанотрубок.

При увеличении концентрации ОСНТ/FITC и длительности инкубации флуоресценция усиливалась. Но при низкой температуре (4оС) она была слабой даже при высокой концентрации и большой длительности эксперимента. Это, по мнению авторов, свидетельствовало в пользу того, что ОСНТ проникли в клетку с помощью эндоцитоза*, т.к. в растениях при низких температурах он блокирован. Механизм эндоцитоза в клетках растениях понят далеко не так хорошо, как для животных клеток, и авторы провели дополнительную проверку. Перед инкубацией они обработали клетки известным ингибитором эндоцитоза в растениях. Это привело к снижению флуоресценции ОСНТ/FITC на 64%, то есть подтвердило их гипотезу.

Таким образом, ученые продемонстрировали, что ОСНТ способны проникать через стенки клеток. Важно отметить, что FITC послужил не только флуоресцентной меткой, указывающей на местонахождение нанотрубок, но и представителем небольших молекул, которые благодаря физической адсорбции на ОСНТ могут быть доставлены в клетку.

Intensivnost.jpgРис.2. Средняя интенсивность флуоресценции для контрольных клеток табака; клеток с флуоресцеином, но без ОСНТ; и клеток с ОСНТ/флуоресцеин

Но способны ли нанотрубки “привозить” в клетку макромолекулы? Для следующего эксперимента авторы [2] использовали однонитевые ДНК, маркированные всё тем же флуоресцеином FITC. Они приготовили суспензию из нанотрубок, обернутых этими молекулами ДНК (“обёртывание” подтверждено данными атомно-силовой микроскопии). Длина ОСНТ/ДНК была менее 500 нм, как и у ОСНТ/FITC. После инкубации клеток BY-2 с конъюгатами ОСНТ/ДНК флуоресценцию наблюдали внутри более 80% клеток (рис.3).

В контрольном опыте, когда в среду роста были добавлены только ДНК/FITC, флуоресценции не было. Таким образом, ДНК с флуоресцеином не способны без “перевозчика” преодолеть клеточную стенку.

Интересно, что распределение флуоресценции в клетках оказалось различным для ОСНТ/FITC и с ОСНТ/ДНК (рис.1 и 3). В первом случае интенсивная флуоресценция наблюдалась в вакуолях (небольших полостях, заполненных клеточным соком), а во втором – в цитоплазматических нитях. Механизм такого разного распределения пока не ясен, тем не менее, результаты указывают на возможность доставки разных грузов в разные отделы клетки.

Microfotografii_0.jpgРис.3. Микрофотографии после инкубации с ОСНТ/ДНК(FITC): А – флуоресцентное изображение; В – светлопольное изображение; С – наложение А и В. (масштабная шкала 10 мкм.)

Результаты исследований показали, что ОСНТ могут эффективно доставлять в клетки растений и небольшие адсорбированные молекулы (FITC), и макромолекулы ДНК. Но не повреждают ли они при этом живые клетки? Для проверки было проделано несколько опытов. Во-первых, проведена длительная (24 ч) инкубация клеток BY-2 c ОСНТ/FITC и с ОСНТ/ДНК(FITC). Она не привела к явной гибели клеток, при этом все клетки сохранили нормальную морфологию и цитоплазматическую текучесть. Далее был использован краситель йодистый пропидий, который легко проникает только в мертвые клетки или клетки с поврежденными плазматическими мембранами и поэтому широко используется для отделения живых клеток от мертвых. Флуоресценции, характерной для окрашивания ядер клеток йодистым пропидием, не наблюдалось ни в опытах с ОСНТ/FITC, ни в опытах с ОСНТ/ДНК. Следовательно, ОСНТ не являются токсичными в отношении клеток BY-2.

Авторы работы [2] впервые показали, что углеродные нанотрубки могут проникать как через клеточную мембрану, так и через клеточную стенку растений. Это свойство может быть использовано для создания эффективных, нетоксичных систем доставки ДНК и небольших молекул в клетку, причем в различные отделы. Несомненно, дальнейшее изучение механизма прохождения ОСНТ “сквозь стены” расширит не только наши знания в области биологии клеток растений, но и возможности практического применения, например, для генетической трансформации растений.

======================

****Эндоцитоз*** – процесс захвата клеткой твердых частиц или живых клеток, капелек жидкости или специфических макромолекул, осуществляемый путем образования мембранных везикул (“пузырьков”). В статье речь идет о поглощении клеткой жидкой фазы.

О. Алексеева

  • 1. ПерсТ 16, вып. 4, с. 5 (2009)
  • 2. Q.Liu et al., Nano Lett. 9, 1007 (2009)
Пожалуйста, оцените статью:
Ваша оценка: None Средняя: 5 (1 vote)
Источник(и):

«ПерсТ»: Углеродные нанотрубки проходят сквозь клеточные стены