Коллективу ученых под руководством Джеймса Бергераиз университета Джона Хопкинса (Балтимор,США) удалось впервые получить кристаллы ДНК-гиразы микобактерий (Mycobacteriumtuberculosis) в комплексес ДНК и различными фторхинолонами, а также установить точную пространственную структуру каталитического центра фермента. Получение точной структуры комплекса позволит использовать рациональный дизайн для создания противотуберкулезных фторхинолонов. Работа исследователей опубликована в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.

Важные вмедицинском смысле антибиотикифторхинолоны воздействуют на бактерийза счет того, что останавливают в клеткахсинтез ДНК. Происходит это путемингибирования ДНК-гиразы, — фермента,который регулирует топологию ДНК. Гираза умеет на короткое время разрезатьДНК и пропускать один ее фрагмент черездругой. Это позволяет распутывыть узлы,неизбежно возникающие при копированиицепей ДНК. Связывание фторхинолонов сгиразой приводит к тому, что фермент неможет сшить разрезанные цепи обратно,синтез ДНК останавливается и бактерия обычно погибает.

СтроениеДНК-гиразы у разных бактерий оченьсхоже, однако гираза микобактерий(бактерий, вызывающих туберкулез, ониже «палочки Коха») значительно болееустойчива к действию фторхинолонов,чем, например, кишечная палочка.

Чтобы определить причины этой устойчивости,ученые попытались установить точную пространственную структуру комплексов микобактериального фермента с ДНК и фторхинолонами.

Для решения таких задач традиционно применяется рентгеноструктурный анализ: ученые исследуют характер дифракции рентгеновских лучей кристаллом белка, в котором все атомы жестко упорядочены. Получение таких кристаллов для большого и подвижного мультисубъединичного фермента, такого как гираза, — задача нетривиальная. Чтобы сделать гиразу более «жесткой» и подходящей для кристаллизации, авторы новой статьи частично укоротили и сшилив месте белковые цепи, из которых она состоит (разумеется, было проверено,что такая модификация не приводит к потере связывания антибиотиков).

Структура комплекса гиразы (синяя и розовая), ДНК (оранжевая) и моксифлоксацина (зеленый). Видно, что антибиотик встраивается между парами оснований — это происходит за счет стекинг-взаимодействия. Изображение: Tim Blower

Полученная структура выявила особенности фторхинолон-связывающего кармана гиразы микобактерий. Как и предполагалось, молекула антибиотика встраивается между основаниями ДНК, которую разрезает фермент (такое взаимодействие называется «стекинг»). Кроме того, она связана с ферментом через «мостик» водородных связей между молекулами воды и ионом магния, участвующим в катализе. Одна из аминокислот, поддерживающих эти связи в гиразах других бактерий — серин — у микобактерий заменена на аланин, который в таких взаимодействиях не участвует; таким образом, молекула антибиотика оказывается связана с ферментом в целом менее стабильно.

Ученые также получили ряд структур с несколькими похожими фторхинолонами, которые отличались друг от друга только боковыми группами, но при этом демонстрировали большой разброс по способности ингибировать гиразу. Оказалось, что водородный «мостик» во всех этих случаях формируется одинаково, поэтому за прочность связывания, видимо, отвечают и другие механизмы: возможно, это нюансы распределения зарядов внутри молекулы,влияющие на силу стекинг-взаимодействия. Так, удаление одного атома кислорода из маленькой боковой группы антибиотика приводит к почти 10-кратному усилению активности, причем такое производное сохраняет способность ингибировать гиразу даже при мутациях, еще больше ослабляющих водородный «мостик».

К сожалению,на данный момент ученые не умеют предсказывать стекинг-взаимодействия достаточно точно, чтобы спроектировать«идеальный» препарат без применения метода проб и ошибок. Слишком резкое усиление взаимодействия с ДНК может привести к тому, что препарат станет токсичным для клеток человека — он начнет ингибировать аналог бактериальной гиразы в человеческих клетках —топоизомеразу. Тем не менее, исследователи могут менять другие потенциально способные контактировать с ферментомчасти молекулы фторхинолона. Теоретически,такие контакты могут усилить связывание с гиразой, но еще важнее то, что многоцентровое связывание позволилобы бороться с мутациями, обеспечивающими устойчивостью к антибиотикам: мутации сразу в двух местах крайне маловероятны.

Туберкулез ежегодно уносит жизни до полутора миллионов человек. Хотя в настоящее время это излечимое заболевание, курс лечения из 3–4 антибиотиков занимает как минимум полгода (до 2 лет в случае лекарственно-устойчивой формы). Дальнейшее распространение устойчивости вызывает большие опасения у врачей (подробнее об этой проблеме мы уже писали). Применение антибиотиков осложняется трудностью постановки диагноза: часто туберкулез ошибочно диагностируют как пневмонию и неправильное лечение вызывает отбор устойчивых клекарствам бактерий в организме пациента.

Фторхинолоныне давно вошли в практику лечения туберкулеза и являются сравнительно нетоксичными и перспективными для дальнейшей разработки препаратами. С другой стороны, проблемы представляю тне только сниженная чувствительность гиразы микобактерий к фторхинолонам, но и наличие в их геноме специального белка, дополнительно защищающего ДНК-гиразу. Традиционным подходом к искоренению заболевания в развитых странах является вакцинация; однако, в Индии и Африке, где туберкулез эндемичен,программа вакцинации столкнулась с большими трудностями и до сих пор не привела к успеху. Даже при наличииогромной политической воли у заинтересованных государств, по оценкам ВОЗ может смениться не менее двух поколений, прежде чем заболевание будет поставлено под контроль.

Автор: Дмитрий Гиляров