Исследователям удалось разработать простой метод для определения фосфорилированных белков. Новая методика может оказаться полезной как для понимания процессов, лежащих в основе коммуникации клеток между собой, так и для разработки способов лечения заболеваний.

Введение или удаление лишь одной фосфатной группы может привести к существенным изменениям в активности белка, зачастую в клетках такая модификация позволяет контролировать изменение функций белков в результате изменения внешних факторов.

Обычно исследователи детектируют фосфопротеины за счет введения в них радиоактивного фосфора или с помощью антител, распознающих строго определенные фосфорилированные аминокислотные остатки. К сожалению, эти методы имеют существенные недостатки – работа, связанная с введением радиоактивных меток небезопасна и, обычно, связана с экспериментальными сложностями, для некоторых фосфорилированных фрагментов белка невозможно.

Рис. 1. В структуре нанополимера (pIMAGO) имеются ионы
титана, прочно связывающиеся с содержащимися в
структуре белка фосфатными группами (P) и биотин,
молекулярная «рукоятка», позволяющая детектировать
авидин, связанный с пероксидазой хрена. (Рисунок из
Anal. Chem., DOI: 10.1021/ac2000708).

Энди Тао (W. Andy Tao) с коллегами из Университета Пэрдю поставили цель разработать метод чувствительного определения фосфорилированных белков без применения радиоактивности или антител. Недавно исследователи сообщили, что они получили сферические наноразмерные полимеры, состоящие из разветвленных молекул полиамидоамина. Исследователи ввели в состав нанополимера ионы титана, образующие прочную связь с фосфатными фрагментами, расположенными на белковых молекулах. С помощью модифицированного полимера удалось выделить фосфопротеины из клеточных экстрактов и идентифицировать их с помощью масс-спектрометрии.

Однако, как отмечает Тао, не каждая исследовательская группа имеет доступ к масс-спектрометрии, и поэтому исследователи разработали методику, которая позволила бы проводить определение фосфопротеинов в рамках обычной лаборатории. Для достижения этого исследователи модифицировали нанополимер, связав его с ферментом – пероксидазой хрена. При введении фермента в нанополимер фермент катализирует реакцию, протекающую с выделением света, причем интенсивность излучения пропорциональна содержанию фосфорилированного белка в образце.

С помощью нового метода экспериментаторам удалось обнаружить 100 пикограммов фосфопротеина, это сравнимо с пределом обнаружения этих объектов существующими методами определения фосфорилированных белков. Новая методика также отслеживать изменения, происходящие с белками в результате введения в систему ферментов, способствующих отщеплению или внедрению фосфорильных групп в молекулы белка. Для демонстрации возможностей нового метода исследователи изучали степень фосфорилирования белка дрожжей Cdh1, выделенного из клеток на различных стадиях фосфорилирования.

Дэниэл Фишер (Daniel Fisher), биохимик из Института Молекулярной Генетики в Монпелье отмечает, что новый метод может оказаться особенно полезным для фармацевтических компаний, пытающихся разработать ингибиторы ответственных за введение фосфорилированных групп ферментов-киназ, которые могут причиной рака.