Ученым из Института биологических исследований Солка (Salk Institute for Biological Studies), США, удалось генетически включить не встречающиеся в живых организмах аминокислоты в нейральные стволовые клетки. Таким аминокислотам можно придать определенные свойства, например, способность флуоресцировать. Флуоресцентные метки-аминокислоты передаются потомкам нейральных стволовых клеток – нейронам головного мозга.

Эта новая методика, описанная он-лайн в журнале Stem Cells, поможет ученым раскрыть загадки различных типов стволовых клеток человека и их дифференцированного потомства и принесет пользу как фундаментальным, так и клиническим исследованиям, ускорив развитие основанной на стволовых клетках регенеративной медицины.

«Стволовые клетки обладают большим потенциалом в лечении различных заболеваний, но изучение того, как они самообновляются и дифференцируются, всегда было сложной задачей», – говорит старший автор исследования доктор Лей Ван (Lei Wang), доцент лаборатории химической биологии и протеомики. «Возможность генетически включать не встречающиеся в живых организмах аминокислоты в белки стволовых клеток углубит наше понимание сигнальных сетей, контролирующих их биологию».

Фотография нейронов, полученных из нейральных
стволовых клеток линии HCN-A94 с инкорпорированной
синтетической аминокислотой. (Фото: Dr. Bin Shen
of the Salk Institute for Biological Studies)

По словам доктора Бина Шена (Bin Shen), первого автора исследования, включение «искусственных» аминокислот «позволяет ученым изучать тот или иной белок в живой клетке или в организме, в отличие от традиционных биохимических методов, когда эксперименты проводятся в пробирке. Более того, за белком с включенной в него флуоресцентной аминокислотой можно наблюдать в режиме реального времени».

Разработанный Ваном и его коллегами метод генетического включения Uaas (unnatural amino acids) был применен на практике на бактериях (в 2001 году) и на клетках млекопитающих (в 2007 году). Сообщение об его использовании на человеческих стволовых клетках – первое.

Исследование, в котором принимали участие химики, молекулярные и клеточные биологи и специалисты в области структуры белков, проводилось в два этапа.

На первом этапе перед учеными стояла задача: выяснить, можно ли включить Uaas в нейральные стволовые клетки, не нарушая при этом процесса их дифференциации, и, если да, передастся ли флуоресцентная метка полученным нейронам.

Используемые сейчас методы включения Uaas не подходят для стволовых клеток, потому что встроенные гены часто теряются до того, как клетке выпадает шанс закончить дифференциацию. Чтобы решить эту проблему и включить Uaas в белки, экспрессируемые нейральными стволовыми клетками, ученые разработали метод доставки генов с помощью лентивирусов.

«Методика лентивирусной генной терапии, создателем которой является доктор Индер Верма (Inder Verma) из Института Солка, позволяет поддерживать длительную экспрессию гена в процессе клеточной дифференциации», – объясняет Ван.

Вирус был использован для доставки нескольких необходимых компонентов: синтетической транспортной РНК (tRNA), с помощью которой клетки включают в образующийся белок аминокислоты, и фермента синтетазы, способной распознать инженерную тРНК и загрузить ее третьей синтетической молекулой – Uaa. Синтетические аминокислоты химически далеки от 20 аминокислот, встречающихся в обычных организмах, и им можно придать различные желательные свойства, например, такие, как флуоресценция.

Лей Ван (Lei Wang), PhD.
(Фото: salk.edu)

«Имея линию стволовых клеток со стабильно инкорпорированными Uaas, мы может использовать эти аминокислоты для изучения биологии таких клеток», – говорит Ван. Кроме того, их дифференциация дает нам различные зрелые клетки, такие как нейроны, в которые трудно включить Uaas и которые дорого закупать в больших количествах».

В первой серии экспериментов исследователи убедились, что Uaas с успехом встраиваются в нейральные стволовые клетки: инкорпорация сохраняется в течение всего процесса дифференциации, и полученные в результате нейроны несут флуоресцентную аминокислоту.

Вторая серия экспериментов продемонстрировала, как флуоресцентные Uaas могут быть использованы для получения ответов на биологические вопросы. Ученые хотели узнать, как в нейронах работают чувствительные к напряжению ионные каналы – белки, образующие поры в клеточных мембранах. В нервных клетках мембранные ионные каналы реагируют на электрический ток  – электрически заряженный сигнал, либо активирующий, либо подавляющий их функцию.

«Мы пытаемся понять, как электрическое поле клеточных мембран включает и выключает функции белков», – поясняет Ван.

Для изучения этого явления ученые встроили флуоресцентную синтетическую кислоту в белковый домен, используемый ионным каналом и другими белками как датчик электрического поля, в нейральных стволовых клетках, которые затем дифференцировались в нейроны с той же Uaa. Теперь они в реальном времени могли наблюдать за флуоресцентной меткой, учитывая изменения в электрическом токе, протекающем через нейрон.

«Мы обнаружили, что при стимуляции нейронов интенсивность флуоресценции Uaa изменяется. Эти изменения зависят от того, где находится Uaa, что позволяет предположить, что в ответ на электрическое поле разные позиции белка перемещаются внутрь мембраны или за ее пределы» – комментирует результаты доктор Ван.

Этот эксперимент, призванный продемонстрировать возможности Uaas при исследовании клеток головного мозга, может быть адаптирован для изучения любых мембранных белков в любых клетках организма, независимо от того, где они находятся.

Аннотация к статье Genetically Encoding Unnatural Amino Acids in Neural Stem Cells and Optically Reporting Voltage-Sensitive Domain Changes in Differentiated Neurons