Используя две экзотические технологии, включая молекулярную версию «подледного лова», группа ученых из Национального института стандартов и технологии (National Institute of Standards and Technology – NIST) разработала методы точного измерения длины нанопоры, мельчайшего канала в клеточной мембране. Описанная ими в недавно опубликованной статье «молекулярная линейка» может служить методом калибровки отдельной нанопоры, чей диаметр в среднем в 10000 раз меньше, чем толщина человеческого волоса. Эта информация может оказаться полезной для большого количества различных приложений, например, для быстрого анализа ДНК.

Исследования в NIST и других научно-исследовательских центрах показали, что отдельная нанометровая пора в тонкой мембране может быть использована как миниатюрная аналитическая лаборатория для обнаружения и описания биологических молекул, таких как ДНК или токсины, когда они проходят через такую пору или блокируют ее. Созданная учеными система теоретически вполне может поместиться в одном устройстве-микрочипе и использоваться для широкого круга приложений. Однако чтобы такая мини лаборатория начала работать на практике, необходимо точное определение размеров и структурных особенностей нанопоры.

Графическое изображение того, как метод «подледного лова» позволяет определить длину нанопоры. Оба изображения показывают цепочки ДНК известной длины с полимерными сферами на конце (оранжевый шарик). Если длина цепочки достаточна для полного прохождения канала (слева), она «поймает на крючок» циркулирующий в растворе полимер (зеленый шарик) с другой стороны мембраны и определит длину нанопоры. Если ее длина недостаточна, ДНК-зонд выскачет из поры (справа). Фото: J.Robertson, NIST

В ходе последних экспериментов исследователи из NIST и Университета Мэриленда (University of Maryland – UM) сначала создали мембрану – двухслойную структуру из молекул липидов – подобную той, которая обнаружена в животных клетках. С помощью специально созданного для проникновения через клеточные мембраны белка (альфа-гемолизина, продуцируемого Staphylococcus aureus) они «просверлили» в своей искусственной мембране наноразмерную пору. Когда на мембрану подается напряжение, заряженные молекулы, такие как одноцепочечные ДНК, устремляются в пору, а поток ионов ослабевает на время, пропорциональное размеру цепочки, что позволяет легко рассчитать ее длину.

Если цепочка достаточно длинна, чтобы достичь самой узкой части нанопоры – известной как пинч-точка – сила электрического поля за ней протолкнет молекулу через оставшуюся часть канала. Используя эту особенность, ученые из NIST и UM разработали метод ДНК-зондирования для измерения расстояния от начала поры с каждой стороны мембраны до пинч-точки и определения общей длины нанопоры путем простого сложения результатов двух предшествующих измерений. Зонды состоят из цепочек ДНК известной длины с полимерной сферой на одном из концов. Сфера не дает зонду целиком пройти через нанопору, оставляя конец протянувшейся вдоль канала цепочки ДНК свободно свисающим из нее. Если цепочка достигает пинч-точки, сила, которая обычно заставляет свободную цепочку ДНК проходить узкий проход, задерживает зонд на месте (так как полимерная сфера блокирует его с другой стороны), что и позволяет определить расстояние до пинч-точки. Если цепочка короче, чем расстояние до пинч-точки, она выскакивает из нанопоры, сообщая ученым, что для измерения расстояния до сужения нужна цепочка большей длины.

Исследователи из NIST и UM разработали и второе средство измерения длины нанопоры для подтверждения результатов, полученных методом «леденца на палочке». В этой системе полимерные молекулы свободно циркулируют в растворе, находящемся с внутренней стороны мембраны. ДНК-датчики различной длины с «надетыми» на них полимерными сферами вынуждены по одному проходить через нанопору с противоположной стороны. Если конец цепочки зонда имеет достаточную длину, чтобы пройти весь канал, он свяжется со свободной молекулой полимера в растворе. Это и определит длину канала.

Кроме того, такой метод «подледного лова» дает представление о структуре нанопоры. Когда цепочка ДНК прокладывает себе путь через канал, изменения электрического напряжения сопровождаются изменениями формы канала и соответствуют им. Эта информация может быть успешно использована для создания карты прохода.

Аннотация к статье: S.E. Henrickson, E.A. DiMarzio, Q. Wang, V.M. Stanford and J.J. Kasianowicz. Probing single nanometer-scale pores with polymeric molecular rulers. The Journal of Chemical Physics 132, 135101