Лазер на свободных электронах - новый инструмент для анализа структуры биочипов

Применение терагерцевого излучения для анализа структуры биочипов

(Из выступления к.б.н. С.Е.Пельтека)

Peltek_S_E.jpg

Пельтек Сергей Евгеньевич, к.б.н., руководитель Лаборатории молекулярных биотехнологий ИЦиГ СО РАН

Данная работа является плодом интеграционной деятельности трех институтов СО РАН: ИЦиГ, ИХКиГ и ИЯФ. Созданный в ИЯФ СО РАН лазер на свободных электронах (ЛСЭ) — уникальная установка, позволяющая проводить научные исследования на самом высоком мировом уровне. Результаты работы основаны на открытом авторами явлении мягкой неразрушающей абляции под действием терагерцевого излучения лазера на свободных электронах.

Терагерцевое излучение представляет собой область оптического спектра между дальним инфракрасным и микроволновым излучениями. Обычно под этой областью подразумевают область излучения с длиной волны от 100 мкм до 500 мкм. По спектральной мощности новосибирский ЛСЭ на сегодня самый мощный в мире, превосходит другие источники на несколько порядков. Получаемое излучение является импульсным, с длительностью импульса примерно 50 пикосекунд, периодом следования импульсов 180 наносекунд и длиной волны излучения от 120 микрон до 240 микрон.

Слово абляция (от позднелат. ablatio — отнятие) согласно словарю имеет следующие значения: уменьшение массы ледника или снежного покрова в результате испарения, зависящее главным образом от климатических факторов; унос веществ с поверхности твердого тела потоком горячего газа (путем эрозии, оплавления, сублимации); лазерная абляция — метод удаления вещества с поверхности лазерным пучком.

Мягкая неразрушающая абляция представляет собой процесс перевода молекул в аэрозольную фазу из твердой или жидкой фазы под действием терагерцевого излучения без разрушения ковалентных связей.

Основными предпосылками для развития метода мягкой неразрушающей абляции были следующие. Энергия связи макромолекул с поверхностью и между собой приблизительно соответствует энергии ТГц кванта. Низкая энергия кванта (~ 0,01 эВ) не может разрушать ковалентные связи. Высокая пиковая мощность источника позволяет проводить абляцию. Следовательно, аблирующие макромолекулы сохраняют свою структуру. На этом основании был развит метод перевода макромолекул в аэрозольную фазу.

Ablatio.jpg

Образцы помещают в специальную камеру. Через окно в камере образец облучают терагерцевым излучением. Аблированные частицы уносятся в токе азота. При помощи разработанного ИХКиГ диффузионного спектрометра аэрозолей определяется их размер. Или же частицы собирают на специальные фильтры для последующего анализа.

Общая схема экспериментов по мягкой неразрушающей абляции

Образцы помещают в специальную камеру. Через окно в камере образец облучают терагерцевым излучением. Аблированные частицы уносятся в токе азота. При помощи разработанного ИХКиГ диффузионного спектрометра аэрозолей определяется их размер. Или же частицы собирают на специальные фильтры для последующего анализа.

Нам удалось поднять в аэрозольную фазу интактную ДНК плазмиды pBScript (3,6 тысяч пар оснований) и ДНК фага lambda (48 тысяч пар оснований). При этом размеры образующихся частиц составили 7 нм и 70 нм соответственно. Было показано, что абляция — неразрушающая, и в результате образуются частицы биополимеров наноразмера в аэрозольной фазе.

Метод мягкой неразрушающей абляции нашел свое естественное применение для анализа структуры биочипов. В последние годы лавинообразно возросло количество исследований с использованием биочипов, которые представляют собой небольшого размера пластинки, несущие на своей поверхности ДНК-пробы. Каждый биочип содержит от сотен до тысяч упорядоченных ячеек с ДНК-пробами. При стандартном анализе целевая ДНК метится флуорохромом. После гибридизации каждое пятно, на котором целевая ДНК связалась с пробой, дает специфический сигнал.

Сканирование и анализ биочипа происходит автоматически. По расположению флуоресцентной окраски судят о результатах анализа.

Массовое применение биочипов в практике показало, что биочипы одного и того же предназначения разных производителей дают разные результаты. В 2004 г. сходимость результатов трех ведущих производителей составляла всего 4 %. Для решения этой проблемы были предприняты гигантские усилия. К 2007 г. сходимость результатов уже составила около 23 %. Низкая сходимость результатов использования биочипов разных производителей затрудняет диагностику, сравнение результатов разных лабораторий, и делает невозможным накопление информации в базах данных.

Сходимость результатов стала фундаментальной проблемой. Наше решение — технология прямого анализа гибридизованных на биочипе целевых ДНК с целью стандартизации производства биочипов.

Общая схема снятия целевых ДНК с поверхности модельного биочипа — та же самая. В качестве целевой ДНК был использован синтетический олигонуклеотид (90 нуклеотидов). В качестве ДНК-пробы на поверхности биочипа был закреплен комплементарный ему олигонуклеотид (15 нуклеотидов). Под действием терагерцевого излучения происходит разрыв водородных связей, стабилизирующих ДНК-ДНК гибрид на поверхности биочипа, и целевая ДНК переводится в аэрозольную фазу.

Целевую ДНК собирали на специальные фильтры, элюировали с них, амплифицировали при помощи ПЦР-реакции и секвенировали. Получено стопроцентное совпадение последовательностей исходной и аблированной ДНК. Таким образом, проведена прямая абляция целевой ДНК с поверхности биочипа, и показано, что метод мягкой неразрушающей абляции применим для анализа целевой ДНК, гибридизованной на поверхности биочипов.

Мы планируем использовать развитую методику для стандартизации производства биочипов. Мировая тенденция производства биочипов направлена на повышение плотности размещения ячеек на поверхности биочипа. Мы ясно осознаем, что длина волны излучения — порядка 100 микрон, следовательно, характерный размер светового пятна будет такого же порядка в диаметре, и при анализе реального биочипа высокой плотности существует опасность снятия целевых ДНК с нескольких соседних ячеек. Однако в последнее время развиты методы ближнепольной микроскопии, дающей возможность концентрировать терагерцевое излучение в пятна размером много меньше длины волны, что позволяет ожидать концентрации излучения в пятно размером несколько микрон, чего вполне достаточно для анализа биочипов высокой плотности.

Еще одно применение метода мягкой неразрушающей абляции — экспресс-измерение размеров наночастиц (от 4 мин).

Предлагаемый метод позволяет решать три задачи: измерять физические размеры наночастиц в диапазоне от 3 до 200 нм; под действием терагерцевого излучения разрушаются агрегаты наночастиц, что дает возможность измерять истинные размеры нанообъектов; изучать процесс образования агрегатов наночастиц.

Авторский коллектив выражает искреннюю благодарность руководству институтов за поддержку работы.

http://pine.ict.nsc.ru/…n50/f10.html

Институт цитологии и генетики СО РАН

Inst_Cit_Gen.jpg

http://www.bionet.nsc.ru/…alog/main.pl

Да, работают люди. Работают, скорее всего, на будущее. Ибо именно в будущем понадобится большое количество такого рода такого рода устройств. Успехов им и новых достижений!..