Тени во льду

На прошлой неделе стало известно, что нобелевская премия по химии 2017 года присуждена за разработки в области криоэлектронной микроскопии — уникального метода, позволяющего определить структуру белков и макромолекулярных комплексов с разрешением, близким к атомарному, без необходимости их кристаллизации. Мы пообщались с сотрудниками единственной в России лаборатории, где установлен современный криоэлектронный просвечивающий микроскоп, а также разобрались в том, как устроена криоэлектронная микроскопия и какую роль сыграли в ее развитии лауреаты премии Жак Дюбоше, Иоахим Франк и Ричард Хендерсон.

Ричарду Фейнману приписывают следующее изречение:

«На многие из фундаментальных биологических вопросов очень легко ответить: достаточно лишь пристально посмотреть на объект». Благодаря криоэлектронной микроскопии наука наконец подошла к рубежу, когда строение макромолекулярных комплексов можно будет узнать, просто посмотрев на них в достаточно мощный электронный микроскоп. Этот метод уже называют революцией в молекулярной биологии.

Если перед вами стоит задача найти лекарство, которое, к примеру, должно связываться с каким-то специальным рецептором и активировать (или наоборот, подавлять) некий процесс в масштабах клетки, то у вас есть два пути. Первый — физически перепробовать сотни (а то и тысячи) химических соединений, руководствуясь интуицией и знаниями об аналогичных активных веществах. Второй — выяснить в деталях структуру этого рецептора и провести все те же самые эксперименты с помощью компьютерного моделирования, а потом протестировать десяток наиболее подходящих соединений. Второй подход выглядит значительно привлекательнее, но без знания трехмерной структуры белков ничего не получится. Причем структура белка нужна, конечно, не только для поиска лекарств. Зная, как устроены белки и, что важнее, белковые комплексы, можно лучше понять молекулярные механизмы процессов в живой клетке, принципы работы ферментов и так далее.

Современная физика предлагает прекрасный метод, позволяющий справиться с изучением структуры молекул, — рентгеноструктурный анализ. Кристаллы веществ работают как сложные дифракционные решетки для рентгеновского излучения. Направив рентгеновский луч на кристалл и зафиксировав на детекторе соответствующую картину рассеяния, можно восстановить форму дифракционной решетки с точностью до положения отдельных атомов — это сложно, но вполне осуществимо с современными компьютерами. На сегодняшний день это уже рутинная процедура. Однако настоящая проблема состоит в другом: без качественного монокристалла белка атомарную структуру восстановить не получится.

Пожалуй, это — едва ли не главное препятствие в структурной биологии. Большинство белков и белковых комплексов либо не желают кристаллизоваться, либо кристаллизуются не в том виде, в котором они существуют в клетке. Другой немаловажный аспект — это подвижность белков. Наша клетка — это динамическая система, и все комплексы в ней претерпевают различного рода изменения. Эти изменения, или, как их называют структурные биологи, конформационные состояния, практически невозможно наблюдать в кристалле, так как молекулы жестко связаны в кристаллической решетке. Потенциально эти сложности можно было бы преодолеть с помощью электронной микроскопии, и поэтому биологи обратили внимание именно на этот метод.

Однако в процессе использования микроскопии возникли некоторые трудности. Во-первых, электронный пучок сам по себе способен взаимодействовать с биологическим образцом и уничтожать молекулы белков, разрывая в них химические связи и ионизируя их. Во-вторых, электронный микроскоп дает слабоконтрастные изображения объектов, состоящих из легких атомов (таких, как водород, углерод, азот и кислород), а чтобы увеличить контраст, необходимо использовать интенсивные пучки электронов. Это породило дилемму: с одной стороны надо, чтобы в микроскопе был высокий вакуум и большая интенсивность пучка электронов, с другой — образец должен находиться в водной среде и не деградировать под воздействием луча. Помимо затруднений с образцом, надо было решить и математическую задачу, а именно: как из набора двумерных проекций (если мы говорим о просвечивающем микроскопе) получить трехмерный объект.

Справиться с этими проблемами удалось не сразу. Если электронный микроскоп был изобретен в 1931 году и к 40-м годам стал коммерчески доступным прибором, то первые структуры молекул с более или менее высоким разрешением были получены только в 70-х — 90-х годах.

«Тени» белковых комплексов Тимур Баймухаметов, Евгений Пичкур / НИЦ «Курчатовский Институт»

В 1940-х годах ученые предложили использовать негативное контрастирование для исследования слабоконтрастных биологических тканей. Образцы (клетки, вирусы) помещали в тонкий аморфный слой из солей тяжелых металлов — именно контраст между тяжелыми и легкими элементами позволял определить их форму. Таким способом были получены трехмерные модели «хвостов» бактериофагов Т4 — вирусов, поражающих бактерии. Они представляют собой полые трубки из белков, уложенных по спирали. Именно через них бактериофаги впрыскивают свою ДНК в бактерию-жертву. В 1982 году в том числе и за эту работу Аарон Клуг получил Нобелевскую премию по химии.

Восстановить трехмерную структуру удалось на основе одной-единственной проекции — одного ракурса — на частицу бактериофага. Это было возможно благодаря тому, что биологи заранее знали о спиральной симметрии в «хвосте» вируса. Без этих данных подобное было бы невозможно. Менее симметричные объекты тоже можно восстановить с помощью нескольких проекций, но эта задача значительно сложнее.

Соответствующий метод обработки и «склеивания» изображений был разработан в 70-х — 80-х годах одним из лауреатов премии 2017 года — Иоахимом Франком, американским биофизиком немецкого происхождения. Франк стоял у истоков криоэлектронной микроскопии — как методологических, так и теоретических. В 1981 году он совместно с ван Хилом предложил математический аппарат для классификации, усреднения и анализа микроскопических изображений молекулярных комплексов. Впрочем, в то время речь, скорее, шла о некоей форме молекулы, что не помешало показать применимость метода на большой (50S) субъединице бактериальной рибосомы.

Общий принцип сборки трехмерной структуры из двухмерных «проекций» («теней») частиц. На первом этапе ученые получают изображение большого количества хаотически расположенных частиц. Затем компьютер классифицирует изображения и помещает похожие проекции в одну группу. Из тысяч изображений в этой группе формируется одно двухмерное изображение высокого разрешения. Затем из серии групповых изображений собирается трехмерная модель высокого разрешения. Nobelprize.org

Среди заслуг Франка числятся также разработка одного из первых программным пакетов SPIDER для метода «одной частицы» (Single Particle Analysis), ставшего практически синонимом криоэлектронной микроскопии, а также демонстрация промежуточных конформаций рибосомы. В настоящее время его лаборатория занимается разработкой новых методик подготовки образцов, в частности распыления с применением микрофлюидики, что, как надеются ученые, позволит добиться временного разрешения порядка десятков микросекунд в криоэлектронной микроскопии.

Чтобы перейти к исследованиям нативной структуры отдельных белков и белковых комплексов с помощью электронного микроскопа, требовалось использовать водные растворы, а не матрицы из солей тяжелых металлов. Было ясно, что избежать осушения образцов в вакууме можно при очень низких температурах. Одновременно с этим нельзя допускать образования кристаллов льда, сильно искажающих картину из-за дифракции. Эти идеи позволили сделать следующий шаг к созданию криоэлектронной микроскопии.

Чтобы вода не успевала образовывать упорядоченные кристаллы льда, охлаждать ее надо очень быстро — значительно быстрее, чем это считалось возможным раньше. Методику для создания аморфной матрицы изо льда, в которой располагаются молекулы белка, предложил в 1980-х годах Жак Дюбоше. Она заключается в следующем. Капля исследуемого раствора помещается на стандартную сетку для образцов с углеродной подложкой и большим количеством отверстий. После удаления избытка раствора сетку быстро погружают в жидкий этан (минус 182 градуса Цельсия), в результате чего как на поверхности сетки, так и в отверстиях образуется тонкая пленка аморфного льда с хаотично расположенными в них частицами. С помощью этой методики группа Дюбоше получила высококачественные снимки суспензий различных вирусов.

Пример классифицированных «проекций» («теней») белков. Тимур Баймухаметов, Евгений Пичкур / НИЦ «Курчатовский Институт»

Впервые криоэлектронная микроскопия биомолекул достигла почти атомарного разрешения в 1990 году, когда британский биохимик Ричард Хендерсон после 15 лет работы наконец получил структуру бактериородопсина с разрешением около трех ангстрем (длина связи углерод-углерод, для сравнения, составляет 1,1–1,5 ангстрема). Этот белок отвечает за перенос протонов через мембрану архей — в качестве источника энергии он использует солнечный свет. Как и многие мембранные белки, соединение оказалось очень хрупким и не только не кристаллизовалось, но и легко разрушалось. Поэтому Хендерсону пришлось работать с тонкими пленками бактериородопсина.

Хендерсон просуммировал около миллиона различных изображений бактериородопсина, чтобы получить структуру с высоким разрешением. Ученый специально использовал очень слабые электронные пучки, чтобы не повредить белок. Это стало первым подтверждением того, что криоэлектронную микроскопию и в самом деле можно использовать для получения высокоточных данных. Впоследствии тот же самый метод был использован другими группами для исследования белков фотосинтезирующего комплекса, аквапоринов и тубулинов.

Ричард Хендерсон не только показал возможность достижения высокого разрешения, но и активно искал новые подходы в области регистрации слабых сигналов. Как результат его работы криоэлектронная микроскопия получила новый тип детекторов – так называемые CMOS камеры. Чувствительность таких детекторов была в самом начале в 2–3 раза лучше чем у CCD, но хуже чем у пленки, сейчас же в результате развития технологии CMOS камеры намного чувствительнее, чем пленка.

Современные микроскопы лишены многих недочетов, с которыми сталкивались при работе нобелевские лауреаты (Хендерсон в буквальном смысле объехал полмира в поисках микроскопа с оптимальными характеристиками). Новые детекторы позволяют работать с пучками низкой интенсивности, а также делать несколько снимков с одной области образца за время съемки за счет увеличившейся скорости считывания. Это помогает компенсировать перемещения белков — механические дрейфы и другие смещения, вызванные взаимодействием частиц с пучком. Кроме того, современные изображения — сумма нескольких индивидуальных коротких снимков, которые после выравнивания между собой суммируются. Этот подход в наборе изображений произвел революцию в разрешении получаемом в криоэлектронной микроскопии.

Метод витрификации Дюбоше — создания тонкого аморфного слоя водного льда, содержащего частицы биомолекул и вирусов. Nobelprize.org

Одновременно с этим растет скорость и качество обработки наборов из многих сотен тысяч «проекций» белков. Это связано не только с развитием компьютерной техники, но и с появлением новых подходов к анализу, в том числе использующих машинное обучение.

С помощью криоэлектронной микроскопии был сделан ряд важных открытий. Например, решена структура рибосомы — за решение этой же задачи, но кристаллографическими методами, в 2009 году лауреатами Нобелевской премии стали Венкатраман Рамакришнан, Томас Стейц и Ада Йонат. Важно заметить, что метод помогает увидеть не только статичные белки, но и различные процессы, в которые они вовлечены. Это позволяет увидеть структурные изменения в биомолекулах в ходе ферментативных реакций. Для традиционной рентгеновской кристаллографии подобное попросту невозможно.

Кроме того, криоэлектронная микроскопия открывает новые горизонты для исследования мембранных белков в липидных нанодисках и других средах. В 2013 году вышла знаменательная статья, в которой была решена структура ионного канала TRPV1 при помощи криоэлектронной микроскопии. В 2016 году с помощью этого же метода было установлено строение вируса Зика. Сразу несколько структур трансмембранных рецепторов GCPR были опубликованы в Nature в июне этого года.

Структура рибосомы, полученная криоэлектронной микроскопией. Диаметр объекта ~20 нанометров. Тимур Баймухаметов, Евгений Пичкур / НИЦ «Курчатовский Институт»

На сегодняшний день криоэлектронная микроскопия — постепенно набирающий популярность метод исследования. В России есть несколько подобных приборов. Самый современный из этих микроскопов, Titan Krios, на данный момент установлен в Курчатовском институте. Чтобы узнать о нем побольше, мы поговорили с Тимуром Баймухаметовым и Евгением Пичкуром, аспирантами НИЦ «Курчатовский институт» и сотрудниками лаборатории электронной микроскопии и Ресурсного центра зондовой и электронной микроскопии соответственно.

Как появилась идея создания центра криоэлектронной микроскопии в России, кто был ее инициатором?

Осознание того, что в структурной биологии грядут перемены, пришло давно. Стратегически верное и важное решение развивать именно данный метод принял президент НИЦ «Курчатовский институт» М.В. Ковальчук. Решение строить именно на базе Курчатовского комплекса НБИКС технологий было не случайным — к этому моменту в КК НБИКС уже функционировала лаборатория электронной микроскопии под руководством А.Л. Васильева и была предусмотрена соответствующая инфраструктура для криогенной микроскопии. Это несколько удешевило проект и существенно ускорило его реализацию. Также необходимо отметить тот факт, что в проекте был предусмотрен доступ к суперсовременному мощному компьютерному кластеру, без которого криоэлектронная микроскопия не может существовать. Так в Курчатовском институте при поддержке потрясающей ИТ-команды в Центре обработки данных (руководитель В.Е. Велихов) было установлено необходимое программное обеспечение и открыт доступ для обработки наших данных. Эффективный доступ к приборной базе был обеспечен благодаря поддержке Ресурсных центров института (руководитель О.В. Акилин).

Стала ли криоэлектронная микроскопия стандартным методом анализа? За последний год в журналах Nature Publishing Group появились уже десятки статей по этой тематике.

Cryo-EM становится рутинным методом анализа. Уже сейчас в мире насчитывается порядка ста единиц hi-end криопросвечивающих электронных микроскопов FEI Titan Krios. Одновременно существуют и менее сложные микроскопы (с меньшим ускоряющим напряжением), позволяющие добиться похожих результатов, но с худшим пространственным разрешением для большинства образцов. В США существуют национальные центры биоимиджинга, например NYSBC, в котором находятся три современных микроскопа Krios’ов.

Вследствие того что микроскопия достигла высокого разрешения, начинают образовываться кластеры для структурных исследований на базе уже существующей инфраструктуры для исследования комплексов методом кристаллографии. Так, на британском синхротроне Diamond Light Source установлено уже четыре микроскопа класса Titan Krios, нечто подобное скоро будет во французском Гренобле. Основное ограничение на данный момент — стоимость оборудования. FEI Krios обойдется заказчику в сумму около шести миллионов долларов, и еще примерно столько же потребуется на организацию инфраструктуры. Лучший в классе детектор обойдется в сумму порядка одного миллиона долларов. Даже для крупного института на Западе это существенные деньги, но, несмотря на это, ряд крупных университетов в США уже имеют криоэлектронные микроскопы.

Рост количества статей во многом связан с тем, что приборов становится все больше. А с Нобелевской премией темпы ускорятся еще сильнее, возрастет интерес к этой области.

Разрешение, достигаемое криоэлектронной микроскопией — слева до 2013 года, справа — сейчас. Nobelprize.org

Как устроен эксперимент сегодня?

Типичный эксперимент выглядит следующим образом: сначала подбирается необходимая концентрация раствора, буквально методом проб и ошибок. На этом этапе готовятся тестовые сетки с разными концентрациями, оценивается гомогенность образца (агрегирует ли он?), примерные условия для заморозки. Все это абсолютно ручные процедуры, требующие от нескольких дней до недель и месяцев. Затем готовятся сетки уже для набора данных, это занимает от 48 часов до недели.

Типичный объем собранных данных варьируется от 1 терабайта до примерно 10 терабайт, в зависимости от типа детектора и параметров набора. У нас благодаря поддержке Ресурсных центров внутри института есть, в некотором смысле, роскошная возможность продлить набор до того момента, пока мы не будем удовлетворены результатом. На Западе обычно рассчитаны точные сессии по 48 часов, и если по каким-то причинам вы не набираете необходимое количество проекций (что-то пошло не так с подготовкой образца или она просто не была проведена достаточно качественно), то вы вынуждены либо ждать следующей сессии — а иногда это несколько месяцев, — либо работать с тем, что получилось.

После этого начинается долгий и, до недавнего времени, суперресурсоемкий процесс обработки изображений, включающий много этапов и кучу различного ПО. Его можно выполнять как на очень мощной рабочей станции с несколькими GPU, так и на суперкомпьютере. Расчет на суперкомпьютере позволяет осуществить полный цикл обработки примерно за 24 часа работы, такие же вычисления на центральном процессоре типичной рабочей станции могут занять год, а то и больше.

****Конечный продукт методики — карта распределения электростатического потенциала белка или комплекса. Дальше существует множество методов того, как построить полноатомную модель белкового комплекса или же скорректировать уже существующую модель, полученную, например, с помощью рентгеновской кристаллографии. В последние годы стало возможным создавать модель de novo, что позволит в будущем решать структуры без привлечения кристаллографии.

Основным требованием для проведения успешных крио-ЭМ экспериментов остаются «правильная» биохимия и качественная очистка объекта интереса. Бутылочное горлышко методики на данный момент — процесс подготовки образцов, который не так далеко ушел от пионерских работ Дюбоше, однако в этом вопросе есть существенные подвижки, как раз связанные с микрофлюидикой и так называемыми самопромакивающимися (self-blotting) сетками.

С какими биомолекулами вы уже работали?

К примеру, совместно с Институтом белка РАН (г. Пущино) мы пытаемся понять механизм трансляции белков в динамике. Мы исследуем структуру полирибосом и пытаемся понять, какие структурные свойства полирибосом обеспечивают высокую эффективность трансляции. Сначала нам надо оптимизировать эксперименты по криоэлектронной томографии полирибосом. Одна из основных задач пробоподготовки здесь — получить такой слой льда, в котором трехмерная структура полирибосом не претерпевала бы никаких изменений. Было здорово наблюдать, как коллеги готовят образцы рибосомных комплексов, в суспензии которых присутствовали короткоживущие состояния, представляющие интерес.

Вообще говоря, мы оба начали свой путь в «крио» благодаря приезду Александра Мясникова в сентябре прошлого года. Мы по сути являемся вторым поколением студентов. До нас Александр работал с двумя другими учениками. Но, к сожалению, так получилось, что первое поколение быстро разъехалось и не успело передать нам навыки. Несмотря на это, Саша, будучи одним из ведущих специалистов по криоэлектронной микроскопии, прилетев в Москву в отпуск, за неделю дал нам суперинтенсивный курс по подготовке образцов, набору данных и их обработке, дал огромный мотивационный заряд и улетел обратно во Францию, в IGBMC, откуда продолжал курировать нашу работу. Сейчас он работает в Университете Калифорнии в Сан-Франциско (UCSF Mission Bay), но мы искренне надеемся на возможность его возвращения на родину, чтобы работать с ним дома, в России, тем более что вся инфраструктура готова и функционирует.

Другой большой проект, поддержанный РНФ, реализуется под руководством Андрея Коневеги, руководящего отделением молекулярной и радиационной биофизики. Помимо фундаментальных структурных исследований динамики рибосом, мы нацелены на вполне практические задачи, связанные с получением новой информации о механизмах действия антибиотиков. Крайне актуальная работа сразу по нескольким направлениям ведется с Институтом биохимии им. А.Н. Баха РАН, а также ИБХ РАН. Кроме того, мы открыты новым предложениям от групп, готовых применить современные методы крио-ЭМ в своих исследованиях.

Есть ли уже первые результаты вашей работы?

Несмотря на короткий срок, у нашей группы уже есть первые результаты. Мы представили их в этом году на первой международной конференции по криоэлектронной микроскопии в России, которая проходила в МГУ и была организована профессором РАН О.С. Соколовой. Один из таких результатов — исследование комплексов рибосомы с антибиотиками. В этой работе мы достигли разрешения на уровне 3 Å. На таком разрешении мы можем уверенно сказать, где расположен антибиотик, и предложить модель его взаимодействия с рибосомой. Подобного рода исследования позволяет нам понять природу взаимодействия и специфичности антибиотиков, а также позволяет предположить, какие из модификаций антибиотика могут усилить его действие.

Мы также пробуем работать с объектами со значительно меньшими размерами. Так, в данный момент готовится к публикации работа, в которой мы подтвердили структуру энзима, решенную ранее с высоким разрешением на курчатовском синхротроне. Одновременно, используя полученный опыт, мы подбираем параметры эксперимента для реконструкции структуры в некотором смысле похожего комплекса с неизвестной полноатомной моделью. Предварительные результаты данного проекта успели побывать на постерной сессии школы по криоэлектронной микроскопии, проходившей этой осенью в Лондоне.

В 1997 году на конференции по трехмерной электронной микроскопии коллега Ричарда Хендерсона начал встречу с фразы о том, что криоэлектронная микроскопия — нишевый метод, который вряд ли когда-нибудь достигнет точности рентгеновской кристаллографии. В ответ на это Хендерсон начал свой доклад так: «Нам надо стремиться к глобальному превосходству криоэлектронной микроскопии над другими структурными методами». Как отмечает Юэн Коллуэй, редактор Nature, спустя двадцать лет эта фраза уже не выглядит преувеличением.

Автор: Владимир Королёв

Пожалуйста, оцените статью:
Ваша оценка: None Средняя: 4.5 (2 votes)
Источник(и):

nplus1.ru